人脈絡膜血管細胞

人脈絡膜血管細胞需要準備好細胞所要用到的培養(yǎng)基和相關試劑，雖然所有的貼壁，半貼壁或者懸浮細胞處理方式差不多，但是不同的實驗室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在，也會導致對細胞處理不當，  或者環(huán)境的不適應而造成細胞的死亡。
人脈絡膜血管細胞培養(yǎng)物的生理環(huán)境不同時定義為其物理化學環(huán)境中，更好地理解血清的組件，所必需的增殖的生長因子的鑒定，并更好地理解細胞在培養(yǎng)的微環(huán)境（即，細胞 - 細胞相互作用，氣體的擴散，與基質(zhì)相互作用）現(xiàn)在允許在無血清培養(yǎng)基中某些細胞系的培養(yǎng)。
培養(yǎng)物的主要優(yōu)點是操縱物理化學（即，溫度，pH，滲透壓，O2和CO2張力）和生理環(huán)境（即，激素和營養(yǎng)物濃度），其中所述細胞繁殖的能力。除溫度，將培養(yǎng)環(huán)境是由生長培養(yǎng)基進行控制。
對于培養(yǎng)，只要我們細心操作，注意細節(jié)，并不是大家說的那樣困難。對于有經(jīng)驗和有條件的客戶，建議由公司代為培養(yǎng)細胞及進行后續(xù)研究。

細胞概述

細胞(英文名: cell) 并沒有統(tǒng)一的定義，比較普遍的提法是:細胞是生物體基本的結(jié)構(gòu)和功能單位。已知除病毒之外的所有生物均由細胞所組成，但病毒生命活動也必須在細胞中才能體現(xiàn)。一般來說， 細菌等絕大部分微生物以及原生動物由一個細胞組成，即單細胞生物，高等植物與高等動物則是多細胞生物。細胞可分為原核細胞、真核細胞兩類，但也有人提出應分為三類，即把原屬于原核細胞的古核細胞獨立出來作為與之并列的一 類。研究細胞的學科稱為細胞生物學。細胞體形極微，在顯微鏡下始能窺見，形狀多種多樣。主要由細胞核與細胞質(zhì)構(gòu)成，表面有細胞膜。高等植物細胞膜外有細胞壁，細胞質(zhì)中常有質(zhì)體，體內(nèi)有

葉綠體和液泡，還有線粒體。動物細胞無細胞壁,細胞質(zhì)中常有中心體，而高等植物細胞中則無。細胞有運動、營養(yǎng)和繁殖等機能。

細胞特性:

1)組織來源于實驗動物的正常胃組織。

2)細胞鑒定：廣譜（PCK）或細胞-19（CK-19）免疫熒光染色為陽性。經(jīng)鑒定細胞純度高于90%。

3)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。

4)細胞生長方式：鋪路石狀細胞，不規(guī)則細胞，貼壁培養(yǎng)。

產(chǎn)品規(guī)格：>5×105細胞數(shù)

包裝規(guī)格：1ml凍存細胞懸液或T-25培養(yǎng)瓶

操作要點：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)解凍，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。

細胞培養(yǎng)操作

1）復蘇細胞：將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 min（視細胞情況而定），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

c、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例；

a、收集細胞，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

產(chǎn)品的運輸和保存：

視天氣狀況和運輸距離遠近，公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進行。

1)1mL凍存細胞懸液裝于1.8ml的凍存管中，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進行運輸；收到細胞后請盡快解凍復蘇細胞進行培養(yǎng)，如無法立刻進行復蘇操作，凍存細胞可在-80℃的條件下保存1個月。

2)T-25培養(yǎng)瓶充滿培養(yǎng)基后進行常溫運輸；收到細胞后請鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，如鋪瓶率超過85%請立即進行傳代操作，如懸浮的細胞較多，請將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細胞能夠再次貼壁。

友情提示注意以下幾點：

1、收到細胞后請盡快更換為含15%血清的新鮮培養(yǎng)基，如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶，請在原瓶培養(yǎng)基中額外添加10%的血清

2、貼壁細胞收到當天切忌立刻消化，請將細胞換液后放置培養(yǎng)箱孵育到第二天再做消化傳代，請優(yōu)先選擇直徑6cm的培養(yǎng)皿進行傳代培養(yǎng)

3、如簽收時出現(xiàn)培養(yǎng)瓶壁破裂，漏液等情況請及時做好照片記錄并聯(lián)系實驗室

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